Antimikróbne pôsobiace látky produkované baktériami mliečneho kvasenia

Souhrn

Baktérie mliečneho kvasenia zahŕňajú viaceré rody gram pozitívnych baktérií, ktoré sú známe produkciou rôznych antimikróbnych látok. Kyselina mliečna a príbuzné organické kyseliny – obligátne metabolity sacharidov, inhibujú rast niektorých iných mikroorganizmov hlavne znížením pH prostredia. Bakteriocíny, proteínové antimikróbne látky, sú produkované ribozomálne a u mliečnych baktérií sú pomerne dobre preskúmané. Niektoré druhy ako napríklad Lactobacillus reuteri sú schopné produkovať špecifické látky rôznej štruktúry. Jedna z nich, reutericyklín – derivát kyseliny tetrámovej – je prvým objaveným antibiotikom produkovaným mliečnymi baktériami. Reuterín, komplex 3–hydroxypropiónaldehydu a jeho príbuzných foriem, je silná antimikróbne pôsobiaca látka, ktorú produkujú viaceré druhy rodu Lactobacillus. Vďaka nepatogénnemu charakteru baktérií mliečneho kvasenia, môžu byť použité ako konzervanty potravín alebo ako nádejné antimikróbne látky v terapii ľudí a/alebo zvierat.

Kľúčové slová:
baktérie mliečneho kvasenia – probiotiká – antimikróbne pôsobiace látky

Úvod

Baktérie mliečneho kvasenia v ostatnom čase nachádzajú uplatnenie v rôznych oblastiach života. V potravinárskom priemysle sú vďaka produkcii antimikróbnych látok využívané ako prírodné konzervanty a tiež dávajú charakteristickú chuť a konzistenciu niektorým potravinám (napr. kefír, kyslá kapusta, syr, kysnuté cesto, kyslé uhorky, jogurt, víno, saláma). Kmene niektorých rodov mliečnych baktérií sa uplatňujú v proiotických prípravkoch používaných v humánnej a veterinárnej medicíne pre ich prospešné účinky na zdravie konzumentov. Skupina mliečnych baktérií zahŕňa rody schopné produkovať kyselinu mliečnu zo sacharidových zdrojov. Z baktérií s nízkym obsahom guanínu a cytozínu (G+C) v genóme sú to rody Aerococcus, Alloiococcus, Atopobium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Paralactobacillus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus a Weissella. Okrem toho medzi mliečne baktérie radíme aj niektoré rody s vysokým obsahom G+C párov, a to napr. Bifidobacterium, Gardnerella, Scardovia a Parascardoviav ¹⁾. Baktérie mliečneho kvasenia sú gram-pozitívne, netvoria spóry a zvyčajne sú nepohyblivé. Pre limitované biosyntetické schopnosti majú zvyčajne vysoké nároky na živiny, získavané z okolitého prostredia ²⁾.

Už na začiatku 20. storočia Iľja Mečnikov predpokladal, že niektoré potraviny ako fermentované mlieko a mliečne produkty napomáhajú eliminovať škodlivé baktérie z gastrointestinálneho traktu ľudí a nahradiť ich prospešnými ³⁾. Za toto sú pravdepodobne okrem iného zodpovedné práve antimikróbne pôsobiace látky, produkované mliečnymi baktériami. Jedná sa o látky rozmanitej chemickej povahy, mechanizmu účinku a antimikróbného spektra účinku. Vďaka týmto látkam sú baktérie mliečneho kvasenia schopné inhibovať rast alebo usmrcovať iné mikroorganizmy, ktoré sa nachádzajú v ich environmentálnom okolí.

Kyselina mliečna a iné organické kyseliny

Organické kyseliny – mliečna, octová, propiónová, maslová a mravčia sú produkované počas anaeróbneho metabolizmu uhľovodíkov ⁴⁾. Antimikróbny efekt týchto kyselín súvisí s narušením membránového potenciálu atakovanej bunky, inhibíciou aktívneho transportu cez membránu, redukciou intracelulárneho pH a inhibíciou rôznych metabolických funkcií bakteriálnej bunky ⁵⁾.

Medzi organické kyseliny produkované niektorými druhmi mliečnych baktérií môžeme zaradiť aj kyselinu pyroglutámovú (kyselina 2–pyrolidón–5–karboxylová) prítomnú v ovocí, zelenine, trávach ⁶⁾ a rôznych druhoch syrov ⁷⁾. Cesta jej biosyntézy nie je zatiaľ jednoznačne potvrdená. Pravdepodobne sa začína z Glu a Gln, a toneenzymatickou alebo enzymatickou syntézou. Zapojenie enzýmu cyklotransferázy do biosyntézy kyseliny pyroglutámovej bolo potvrdené u Pseudomonas cruciviae a Streptococcus bovis ^{8, 9)}. Kyselinu pyroglutámovú nachádzame vo voľnej forme, ale aj viazanú na terminálny dusík proteínov ⁷⁾, ktoré tak môže chrániť pred degradáciou ¹⁰⁾. Väzba pyroglutamátu na rôzne bioaktívne peptidy je spojená s ich biologickou aktivitou ¹¹⁾. Tieto modifikované peptidy pôsobia napríklad ako antagonisti excitačných aminokyselín ¹²⁾, mozgové stimulátory ¹³⁾ a anxiolytiká ¹⁴⁾. Pri rovnakej koncentrácii má kyselina pyroglutámová silnejší antimikróbny účinok ako kyselina mliečna ¹⁵⁾. Zdá sa, že pôsobí podobným mechanizmom ako ostatné organické kyseliny ⁶⁾.

Peroxid vodíka

Peroxid vodíka je radený k mimoriadne silným a biologicky aktívnym molekulám. Reaguje s lipidmi, proteínmi a nukleovými kyselinami a je zodpovedný za oxidačné poškodenia bunky ¹⁶⁾. Niektoré druhy rodu Lactobacillus sú schopné produkovať peroxid vodíka do okolitého prostredia, kde hrá úlohu v inhibícii rastu niektorých baktérií, ktoré nedisponujú ochrannými mechanizmami. Medzi tieto mechanizmy patrí napríklad schopnosť produkcie katalázy alebo peroxidázy, ktoré rozkladajú peroxid vodíka. Medzi baktérie citlivé na peroxid vodíka patria prevažne obligátne anaeróby ako napr. Prevotella alebo Peptostreptococcus ¹⁶⁾, ktoré sú pôvodcami bakteriálnych vaginóz ¹⁷⁾. Hawes et al. ¹⁸⁾ zistili, že u žien, ktoré majú pošvu osídlenú kmeňmi laktobacilov produkujúcich H₂O₂, je incidencia bakteriálnych vaginóz o polovicu nižšia ako u žien, ktoré nie sú kolonizované H₂O₂-produkujúcimi kmeňmi. Z hľadiska spektra účinku peroxid vodíka pôsobí na gram-pozitívne (G⁺) baktérie bakteriostaticky a na gram-negatívne (G^-) baktericídne¹⁹⁾.

Oxid uhličitý

Oxid uhličitý produkujú najmä heterofermentatívne baktérie mliečneho kvasenia pri fermentácii hexóz, ale je tvorený v baktériách aj inými metabolickými cestami (napr. fosfopentózovým cyklom, alkoholovým, propiónovým, butándiolovým, prípadne zmiešaným octovým kvasením) ²⁰⁾. Anaeróbne prostredie, vytvárané prítomnosťou CO₂ je toxické pre niektoré aeróbne mikroorganizmy, u ktorých pôsobí na ich bunkovú membránu. Za mechanizmus účinku sa považuje inhibícia enzymatickej dekarboxylácie a porušenie permeability membrány nahromadením CO₂ vo fosfolipidovej dvojvrstve ¹⁹⁾. Røssland et al.²¹⁾ detegovali schopnosť laktobacilov produkovať okrem iného oxid uhličitý, pričom testovali schopnosť vybraných kmeňov inhibovať rast Bacillus cereus NVH 45. Kmeň Latobacillus diacetylactis 184_L, ktorý sa vyznačoval výrazne vyššou produkciou CO₂ v porovnaní s ostatnými testovanými kmeňmi, inhiboval rast B. cereus účinnejšie ako ostatné kmene. Zdá sa ale, že funkcia CO₂ v inhibícii rastu vybraných baktérií je len sekundárna, hlavná časť účinku sa pripisuje kyseline mliečnej ²¹⁾. Uvádza sa, že G^- baktérie sú citlivejšie na prítomnosť CO₂ ako G^{+ 22)}.

Nízkomolekulové látky

Reutericyklín

Reutericyklín (3-acetyl-1-(2-trans-decenoyl)-2-hydroxy-(5R)-izobutyl-Δ²-pyrrolín-4-ón (obr. 1) je prvým objaveným nízkomolekulárnym antibiotikom, produkovaným baktériami mliečneho kvasenia ²³⁾. Jeho molekula s relatívnou molekulovou hmotnosťou 349 Da je odvodená od kyseliny tetrámovej ²⁴⁾, má amfifilný charakter, záporný náboj a je vysoko hydrofóbna ^{25, 26)}. Höltzel et al. ²⁷⁾ pri ¹³C NMR analýze zistili, že molekula reutericyklínu prešmykuje medzi troma tautomérmi, pričom dominuje forma 2, ktorá má až 60% zastúpenie (obr. 1). Čo sa týka chemickej štruktúry, zaujímavé je pripojenie α, ß-nenasýtenej mastnej kyseliny, ktorá sa v tetrámových kyselinách prirodzene nevyskytuje ^{28, 29)}.

Produkcia reutericyklínu bola zaznamenaná u kmeňa Lactobacillus reuteri LTH 2584, ktorý bol izolovaný z kysnutého cesta ²⁴⁾. Pridanie mastných kyselín do média má výrazný vplyv na zvýšenie produkcie reutericyklínu a jeho sekréciu z producentských buniek ²⁵⁾. Gény, ktorých produkty sú zapojené do biosyntézy tetrámových kyselín, zatiaľ nie sú známe ani u baktérií ani u húb. Taktiež biosyntetické cesty vzniku reutericyklínu nie sú zatiaľ preskúmané ²³⁾.

Reutericyklín má široké spektrum účinku voči G⁺ baktériám (Lactobacillus spp., Bacillus subtilis a B. cereus, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Listeria innocua). G^- baktérie a kvasinky sú voči nemu rezistentné ²⁴⁾. Mechanizmus účinku reutericyklínu je podobný mechanizmu pôsobenia slabých organických kyselín. Predpokladá sa, že nespôsobuje vznik pórov v membráne cieľových buniek, ale účinkuje ako protónový ionofór. Vďaka svojej hydrofóbnosti sa začlení do cytoplazmatickej membrány a selektívne rozvráti transmembránový pH gradient ²⁵⁾.

Reuterín

Viaceré rody baktérií sú schopné za anaeróbnych podmienok produkovať z glycerolu látku s antimikróbnymi vlastnosťami, 3-hydroxypropiónaldehyd (3-HPA, reuterín (obr. 2). Reakciu katalyzuje glyceroldehydratáza (EC 4.2.30). Spomedzi mliečnych baktérií majú túto schopnosť niektoré kmene piatich druhov rodu Lactobacillus: Lactobacillus A 2-8 ³⁰⁾, L. brevis ³¹⁾, L. buchneri ³¹⁾, L. reuteri ³²⁾ a L. collinoides ³³⁾. 3-HPA vykazuje široké antimikróbne spektrum účinku. Zaznamenaná bola jeho antibakteriálna, antifungálna, antiprotozoálna a antivírusová aktivita. Žiadne negatívne účinky reuterínu na ľudské bunky zatiaľ nie sú známe ^{34, 35)}.

Antibakteriálnu aktivitu reuterínu voči Listeria monocytogenes a Escherichia coli O157:H7, ktorú zistili El‑Ziney et al. ³⁶⁾, je možné využiť v potravinárstve, ako biokonzervant, alebo v probiotických prípravkoch (BioGaia^®, Ewopharma s.r.o., Švajčiarsko). Okrem toho môže mať 3-HPA uplatnenie v priemysle ako alternatívny zdroj kyseliny akrylovej, monoméru pre výrobu plastov a polymérov ³⁷⁾.

Reuterín tvorí dynamický multikomponentný systém (HPA systém) zahŕňajúci 3-HPA, HPA-hydrát a dimér HPA (obr. 2). Biologickej aktivity sa pravdepodobne zúčastňujú viaceré formy reuterínu. Hemiacetál HPA-diméru má štruktúru podobnú pentózam, čiže aj D‑ribóze. Jedným z predpokladaných mechanizmov účinku reuterínu môže byť kompetícia HPA-diméru s ribonukleotidmi o väzbové miesto na ribonukleotidreduktáze, enzýme podieľajúcom sa na tvorbe deoxyribonukleotidov ³⁸⁾. Iným vysvetlením antibakteriálneho pôsobenia reuterínu je možná interakcia aldehydových a alkoholových skupín reuterínu s nestabilnými sulfhydrylovými skupinami ribonukleotidreduktázy a tioredoxínu ³⁹⁾.

Bakteriocíny

Okrem vyššie uvedených antimikróbne pôsobiacich látok sú mliečne baktérie významné produkciou tzv. bakteriocínov. Jedná sa o látky peptidovej povahy, ktoré sú produkované ribozomálne. Niektoré molekuly sú tepelne a proteolyticky odolné, čo prispieva k ich možnému využitiu v praxi, či už potravinárskej alebo klinickej. Najznámejším a najpoužívanejším bakteriocínom je nizín, ktorý sa využíva pri spracovaní mliečnych produktov a pri konzervovaní potravín. Je produkovaný kmeňmi Lactoccocus lactis ⁴⁰⁾. Bakteriocíny ako skupina antimikróbnych substancií predstavujú širokú paletu látok a zaslúžia si viac priestoru v samostatnom prehľade ⁴⁰⁾.

Záver

Vďaka schopnosti mliečnych baktérií produkovať antimikróbne pôsobiace látky rôznej chemickej povahy, javia sa tieto baktérie veľmi zaujímavé pre potravinársky priemysel ako prírodné konzervanty. Pre ich probiotické účinky im v ostatnom období venuje veľkú pozornosť aj farmaceutický priemysel. Jedná sa predovšetkým o schopnosť mliečnych baktérií modifikovať mikroflóru tráviaceho traktu a pohlavných orgánov v prospech komenzálnych druhov, potláčať postantibiotické a cestovateľské hnačky, modulovať imunitný systém hostiteľa, znižovať hladinu cholesterolu v krvi a i. Tieto účinky boli zaznamenané u ľudí aj hospodárskych zvierat ⁴¹⁾.

Kvôli stále sa zvyšujúcej rezistencii patogénnych mikroorganizmov voči antibiotikám, používaným v praxi je štúdium nových antimikróbnych látok opodstatnené a využiteľné ako vo farmaceutickom, tak v potravinárskom priemysle. Vďaka stále sa rozširujúcemu výskumu antimikróbne pôsobiacich látok a možnosti špecifického výberu medzi široko a úzko spektrálnymi antimikróbnymi látkami je veľký predpoklad, že nevznikne voči nim rezistencia.

Adresa pro korespondenci:

PharmDr. Hana Kiňová Sepová
Katedra bunkovej a molekulárnej biológie liečiv FaF UK
Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, SR
e-mail: kbm@fpharm.uniba.sk