Fenylpropanoidy a flavonoid z Helichrysum petiolare Hilliard & B. L. Burtt

Souhrn

Fytochemická analýza methanolického extraktu Helichrysum petiolare Hilliard & B. L. (Asteraceae) prokázala přítomnost sekundárních metabolitů patřících mezi fenylpropanoidy a flavonoidy. Pomocí preparativní HPLC se podařilo vyizolovat pět obsahových látek: kumarin skopolin (1), kyselinu 3-chlorogenovou (2), glukosidicky vázaný derivát kyseliny kávové (3), kyselinu dikafeoylchinovou (5) a flavonoid isokvercitrin (4). V druhu H. petiolare byly tyto sloučeniny identifikovány poprvé. Při testování antibakteriální aktivity bylo zjištěno, že pouze kyselina dikafeoylchinová vykazuje mírnou antibakteriální aktivitu proti Escherichia coli CCM 7929 v koncentraci 512 μg ∙ ml^–1.

Klíčová slova:

HPLC – Helichrysum petiolare – rostlinné fenoly – antibakteriální aktivita

Úvod

Druhy rodu Helichrysum Mill. se objevují jako okrasné rostliny v  Evropě, hojně jsou rozšířené v  jihozápadní Asii a v Austrálii, nicméně v nejvyšším počtu se vyskytují v  jižní Africe, včetně Madagaskaru¹⁾. Pro svoje antibakteriální a antiflogistické účinky se v lidovém léčitelství využívají zejména listy a kořen ve formě nálevů a odvarů při léčbě různých infekcí respiračního a trávicího traktu. Extrakty lze využít i zevně ve formě mastí na špatně se hojící rány²⁾.

Rostliny rodu Helichrysum jsou zdrojem celé řady bioaktivních látek. Jde zejména o  fenolické kyseliny (kyselina kávová, kyselina chlorogenová, kyselina ferulová), flavonoidy, kumariny, floroglucinoly a  pyróny³⁾. Druh H. petiolare, který zařazujeme mezi jihoafrické druhy, obsahuje hlavně silici bohatou na seskviterpeny, z nadzemních částí byl dále vyizolován chalkon 2´,6´-dihydroxy-4´-metoxychalkon, flavonoid 5-hydroxy-7,8- -dimetoxyflavon, pyron ocimepyron a acylfloroglucinol humulonmetyléter⁴⁾.

Některé fenolické sloučeniny jsou v  rostlině syntetizovány ve větší míře jako reakce na patogenní agens při poranění, velmi často jsou pak kumulovány v tomto místě, a brání tak poškozenou část a v konečném důsledku celou rostlinu před infekcí. V řadě studií bylo prokázáno, že rostlinné fenoly včetně flavonoidů, kumarinů a fenolických kyseliny vykazují antibakteriální aktivitu⁵⁾. Vzhledem k  využití rostlin rodu Helichrysum v  lidovém léčitelství, byly izolované sloučeniny podrobeny testování antibakteriální aktivity s  využitím mikroorganismu Escherichia coli. Jde o gramnegativní, fakultativně anaerobní bakterii nacházející se v intestinálním traktu člověka, nicméně některé virulentnější kmeny mohou být příčinou závažných onemocnění, zejména močového a trávícího systému⁶⁾.

Testované látky byly vyizolovány z  methanolického extraktu H. petiolare pomocí preparativní HPLC a identifikovány pomocí spektrálních metod (UV, IČ, MS) a nukleární magnetické rezonance (NMR).

Pokusná část

Chemikálie a roztoky

Acetonitril CHROMASOLV^TM pro HPLC, ≥ 99,9  % (Honeywell – Riedel de Haën, SRN), kyselina mravenčí p. a., ≥ 98 % (Honeywell – Fluka, SRN), voda pro HPLC deionizovaná (Milli-Q, Millipore, USA), methylalkohol p.a. (Penta, ČR), dimethylsulfoxid, ≥ 99,9 % (Sigma – Aldrich, USA), živné médium s 1% peptonem M244 (HiMedia, ČR).

Přístroje a zařízení

HPLC/DAD/ESI-MS HP Agilent 1100 (Hewlett-Packard, USA) s  kolonou Ascentis Express RP-AMIDE (10 cm × 2,1 mm × 2,7 μm) v  analytickém módu a  Ascentis RP-AMIDE (25 cm × 10 mm × 5 μm) v  preparativním módu, rotační vakuová odparka (Büchi Labortechnik, Švýcarsko), lyofilizátor Alpha 1-2LD (Martin Christ GmbH, SRN), mikrodestičkový reader UV/VIS – SPECTROstar® Omega (BMG Labtech, SRN), NMR Jeol JNM-ECZ400R 400 MHz (Jeol, USA), IČ spektrometer Nicolet Impact 410 FTIR (Thermo Scientific, USA).

Rostlinný materiál a příprava extraktu

Nadzemní části H. petiolare nasbírané v říjnu 2014 byly hned po sběru zamrazeny na teplotu –60 °C. Před použitím bylo 1,3 kg materiálu rozdrobněno na velikost vhodnou pro extrakci a extrahováno methanolem v poměru 1 : 20 (m/V). Extrakce probíhala při teplotě místnosti (25 °C) 24 hodin. Po filtraci byl extrakt odpařen na rotační vakuové odparce do sirupovité tekutiny, která byla lyofilizována. Na izolaci obsahových látek byl použit 1 g lyofilizátu, který byl rozpuštěn v 5 ml methanolu.

HPLC metody

Pro analýzu extraktu a izolovaných látek byla využita gradientová eluce: acetonitril (0 min 10,0 %, 36 min. 100 %) a 40 mM kyselina mravenčí (0 min 90 %, 36 min 0 %), nástřik 1 μl, průtok 0,3 ml ∙ min^–1, teplota kolony 40 °C. UV detekce při 350 nm, hmotnostní detekce s elektrosprejovou ionizací (ESI/MS). Při preparativní HPLC byla využita stejná gradientová eluce s nástřikem 30 μl a průtokem 4 ml ∙ min^–1.

Stanovení antibakteriální aktivity⁷⁾

Do jamky na mikrotitrační destičce bylo napipetováno 80 μl kultivačního média a 20 μl testované látky rozpuštěné v DMSO a naředěné médiem (512 μg ∙ ml^–1, max. 5 % DMSO). Následně bylo provedeno naočkování referenčním kmenem Escherichia coli CCM 7929. Kultivace probíhala 24 hodin při teplotě 37 °C. Vyhodnocení bylo založeno na měření absorbance v  jednotlivých jamkách (A_vzorku) při vlnové délce 600 nm. Stanovení bylo prováděno ve třech opakováních, kontrolní vzorek (A_kontrola) obsahoval jen kultivační médium s mikroorganismem (kontrola) a  slepý pokus (A_blank) jen kultivační medium. Růst baktérií v % byl vypočítán podle vzorce:

[(A_vzorku – A_blank) / A_kontrola)] × 100

Výsledky a diskuze

Fytochemická analýza methanolického extraktu H. petiolare prokázala přítomnost pěti dominantních obsahových látek (obr. 1), které byly vyizolovány pomocí preparativní HPLC. UV spektrum látky 1 vykazuje zřetelná maxima při 230 nm, 290 nm a 340 nm. Na IČ spektru je vidět široký pás charakteristický pro hydroxylové skupiny (3750–3000 cm^–1), vibrace C=O skupiny (1716 cm^–1), látka má aromatický charakter (pásy 1650–1400 cm^–1) a velmi výrazná je také vibrace C-O-C vazby (1076 cm^–1). Může se tedy jednat o glykosid. V MS spektru v pozitivním módu je patrný molekulární iont [M+H]⁺ v m/z 355. Pomocí NMR analýzy byla látka na základě srovnání s  literaturou identifikována jako kumarin skopolin⁸⁾. V  rodu Helichrysum byl skopolin detegovaný v  druhu H. arenarium⁹⁾.

Na základě srovnání UV spektra s knihovnou spekter byla látka 2 identifikována jako kyselina 3-chlorogenová (kyselina 3-O-kafeoylchinová). To bylo potvrzeno společným nástřikem se standardem a  MS analýzou, kdy v  negativním módu je patrný molekulární iont [M-H]^– v m/z 353 s následný fragmentem v m/z 191, což odpovídá iontu kyselina chinové¹⁰⁾. V druzích rodu Helichrysum je kyselina 3-chlorogenová běžná²⁾.

Látka 3 vykazuje na UV spektru absorpční maxima při 250 nm a 325 nm s ramenem při 295 nm. Podle IČ spektra jde o látku s hydroxylovými skupinami (vibrace 3100–3500 cm^–1), karboxylové skupině by mohl odpovídat pás okolo 1600 cm^–1. Vazbu C-O-C signalizuje široký pás při 1066 cm^–1. V negativním módu je patrný iont [M-H]^– v m/z  449. Při MS/MS fragmentaci jsou patrné fragmenty štěpení kyseliny kávové¹¹⁾. Bohužel látka nebyla izolována v dostatečném množství, aby mohla být dokončena NMR analýza. Z  NMR spektra lze potvrdit, že jde o derivát kyseliny kávové s navázanou glukózou.

Na základě srovnání UV spektra s knihovnou spekter byla látka 4 identifikována jako isokvercitrin, což bylo prokázáno společným nástřikem se standardem a MS analýzou, kdy v negativním módu je patrný molekulární iont [M-H]^– v m/z 463. Tento flavonoid s antioxidační aktivitou se podílí na biologickém účinku extraktů rostlin rodu Helichrysum³⁾.

Látka 5 má velmi podobné UV i IČ spektrum jako látka 2 a 3, v MS spektru je pak molekulární iont [M-H]^– v  m/z  515. V  MS/MS fragmentaci jsou následně fragmenty v m/z  353, 335, 191, 179, 173, 135, což je charakteristické pro dikafeoylchinový derivát. Kyseliny dikafeoylchinové jsou běžné v  druzích rodu Helichrysum, v  portugalském endemitu H. devium byly identifikovány kyselina 1,3-O-dikafeoylchinová, kyselina 3,4-O-dikafeoylchinová, kyselina 1,5-O-dikafeoylchinová a  kyselina 3,5-O-dikafeoylchinová. V  H. obconicum byly identifikovány ještě další dvě kyseliny, kyselina 4,5-O-dikafeoylchinová a  kyselina 1,4-O-dikafeoylchinová¹²⁾. Podle MS fragmentace, retenčního času a  na základě srovnání s  literaturou by mohlo jít o  kyselinu 4,5-O-dikafeoylchinovou¹³⁾, nicméně pro konečnou identifikaci by bylo potřebné změřit NMR spektrum. Látka však byla vyizolována v  množství pouze 2 mg, nebylo tedy možné využít tuto metodu.

V rámci testování biologické aktivity byla otestována antimikrobiální aktivita izolovaných látek na referenční kmen Escherichia coli CCM 7929 metodou měření optické hustoty při 600 nm (obr. 2). Bylo prokázáno, že kyselina dikafeoylchinová (5) vykazovala mírnou antibakteriální aktivitu proti Escherichia coli. V  koncentraci 512 µg ∙ ml^–1 omezila růst na 83 % oproti kontrole, která představuje 100% růst. Nejvyšší aktivitu vykazoval standard antibiotikum ciprofloxacin, který téměř kompletně inhiboval růst E. coli. V literatuře byl studován mechanismus účinku¹⁴⁾. Vnější membrána gramnegativních bakterií se skládá z lipopolysacharidů a proteinů, které jsou vázány elektrostatickými interakcemi s ionty dvojmocných kovů. Aniontové sloučeniny jsou schopné odstraňovat dvojmocné kationty z jejich vazebných míst v  lipopolysacharidové vrstvě, a  tak narušovat jejich integritu. Kafeoylchinové kyseliny se vzhledem ke svému negativně nabitému povrchu mohou vázat na vnější membránu, chelatovat dvojmocné kationty (Mg²⁺) a  tím narušovat její integritu. To vede ke ztrátě její funkce. Interagují také s  cytoplazmatickou membránou, zvyšují její permeabilitu a způsobují iontovou dysbalanci¹⁴⁾. Nicméně podle našich výsledků byla účinná pouze kyselina dikafeoylchinová (5), což můžeme přičítat některým výhodnějším fyzikálněchemickým parametrům molekuly, zejména její vyšší hydrofobicitě a  tím lepší penetraci membránou. Antibakteriální aktivita dikafeoylchinových kyselin je pak ovlivněna pozicí esterů kyseliny kávové na cykloxanovém kruhu. Nejvýhodnější je poloha 5, nutná je také určitá vzdálenost mezi oběma estery¹⁵⁾.

H. petiolare je u  nás hojně rozšířená balkónová rostlina, nicméně v jižní Africe, zejména v oblasti Jihoafrické republiky a Namibie patří mezi nejvýznamnější léčivé rostliny¹⁶⁾. Užívá se při zánětech horních cest dýchacích, infekcích močových cest a jako zevní antiseptikum, zejména pro obsah silice bohaté na terpenoidy. V  naší studii jsme v  extraktu identifikovali obsahové látky ze skupiny polyfenolů, které se v menší míře také mohou podílet na antibakteriální a antiflogistické aktivitě, pro kterou se rostlina v lidovém léčitelství užívá.

Rukopis vznikl na základě diplomové a rigorózní práce PharmDr. Ivany Várady, rozené Džubinské, které obhájila na Farmaceutické fakultě VFU Brno v letech 2017 a 2019.

Konflikt zájmů: žádný.

doc. PharmDr. Renata Kubínová, Ph.D., M. Gazdová, M. Gáborová, L. Molčanová
Masarykova univerzita, Veterinární a farmaceutická univerzita
Farmaceutická fakulta, Ústav přírodních léčiv
Palackého 1/3, 612 42 Brno
e-mail: kubinovar@pharm.muni.cz

I. Várady
Institut klinické a experimentální medicíny, Praha
Ústavní lékárna

M. Nejezchlebová
Masarykova univerzita Brno, Veterinární a farmaceutická univerzita
Farmaceutická fakulta, Ústav molekulární farmacie