Melatonin jako základní stavební jednotka pro léčiva ve vztahu k neurodegenerativním poruchám

Souhrn

Melatonin představuje klíčový hormon produkovaný epifýzou, který je intenzivně zkoumán ve vztahu k neurodegenerativním onemocněním v posledních letech. Kritický je zejména úbytek jeho hladiny ve stáří. Data z klinických studií ukazují na jeho pozitivní vlastnosti ve vztahu ke kvalitě spánku, protizánětlivý a antioxidační potenciál, hojně jsou rovněž diskutovány jeho neuroprotektivní vlastnosti. Předkládaná práce shrnuje poznatky základního výzkumu z oblasti medicinální chemie melatoninu. Zvláštní důraz je kladen na deriváty tohoto hormonu, které cílí na řadu patologických mechanismů neurodegenerativních chorob současně.

Klíčová slova:

acetylcholinesterasa • Alzheimerova choroba • antioxidant • butyrylcholinesterasa • melatonin • neurodegenerativní onemocnění

Úvod

Melatonin (N-[2-(5-methoxy-1H-indol-3-yl)ethyl]acetamid) (obr. 1) je hormon produkovaný zejména epifýzou, v menší míře pak řadou dalších částí organismu, jako jsou např. buňky imunitního systému, mozek, plicní epitel, kostní dřeň, střevo, vaječníky, varlata, kůže a další¹⁾. Snížené hladiny melatoninu hrají klíčovou roli v patogenezi a progresi různých onemocnění včetně neurodegenerativních chorob, nejrůznějších poruch kardiovaskulárního systému, nádorových onemocnění, gastrointestinálního traktu, infekčních chorob a dalších²⁾.

Melatonin hraje důležitou roli v činnosti mozku, imunitního systému i při obranných mechanismech, zejména s ohledem na snižování hladin reaktivních kyslíkových a dusíkových forem. Mechanismus účinku melatoninu může být přímo zprostředkován cestou tzv. melatoninových receptorů, které se nacházejí v centrálním nervovém systému (CNS) a většině buněk imunitního systému³⁾. Samotný melatonin není pouze zodpovědný za regulaci spánku a cirkadiánního rytmu, ale je rovněž regulátorem sekrece dalších hormonů, navyšuje intracerebrální průtok krve a antagonizuje vliv některých excitačních sloučenin typu hormonů nebo aminokyselin. Velkým otazníkem zůstává jeho účinek ve vztahu k imunitnímu systému. Ten se na jednu stranu může projevovat pozitivně, tj. protizánětlivě jako antioxidant, na druhou stranu však může aktivizovat tento systém, což vede ke spuštění prozánětlivé kaskády⁴⁾. Celá řada studií týkajících se neurodegenerativních chorob však hovoří spíše o převažujícím protizánětlivém účinku melatoninu. Tím zmírňuje příznaky oxidativního stresu na různých úrovních, zejména snižováním hladin indukovatelné i neuronální syntasy produkující oxid dusnatý a rovněž zvyšováním hladin antioxidačně účinných enzymů^5–7). Za zmínku stojí dále jeho protektivní účinek vůči mitochondriím, melatonin zachovává elektronový potenciál na membráně zejména stabilizací integrity membrány mitochondrie⁸⁾.

Vztah melatoninu a stárnutí úzce koreluje s nočním vyplavováním tohoto hormonu, kdy především u starších osob dochází k postupné redukci hladin⁹⁾. Melatonin je na základě četných studií považován za unikátní sloučeninu, která je nejen zodpovědná za cirkadiánní rytmus, ale dost možná i prodlužuje délku života, což však nikdy nebylo a pravděpodobně ani nemůže být jednoznačně prokázáno¹⁰⁾. Jeho substituce ve stáří je dnes považována za velice zajímavou alternativu k léčbě kognitivních symptomů, které často provázejí neurodegenerativní choroby. V současné době však zcela chybí jakékoliv údaje k dávkování melatoninu, doporučenému začátku jeho podávání, nejsou známy možné kontraindikace a rovněž chronobiologické následky/aspekty spojené s jeho suplementací.

Multipotentní sloučeniny

S přihlédnutím k výše jmenovaným pozitivním atributům melatoninu a jeho vztahu k neurodegenerativním onemocněním, stárnutí a zánětlivým procesům se tento hormon stal masivně vyhledávanou stavební jednotkou, která je vhodně implementována do nově vyvíjených léčiv typu „multi-target directed ligands“ (MTDLs). Jedná se o multipotentní sloučeniny, které cílí současně na několik patologických mechanismů onemocnění¹¹⁾.

Důvodem pro design sloučenin typu MTDLs je fakt, že dodnes neznáme přesnou příčinu vzniku neurodegenerativních onemocnění. Byla popsána řada hypotéz, z nichž zejména nejvíce relevantní a nejvíce používaná pro současnou léčbu Alzheimerovy choroby (AD) představuje tzv. cholinergní hypotéza poprvé definována roku 1976 a glutamátem navozená excitotoxicita na N-methyl-D-aspartátových (NMDA) receptorech^{12, 13)}. Na těchto dvou hypotézách dodnes staví jediná klinicky užívaná léčiva. Mezi ně patří donepezil, rivastigmin, galantamin jako zástupci inhibitorů acetylcholinesterasy (AChE, E.C. 3.1.1.7) a memantin působící jako antagonista na NMDA receptorech (obr. 2)¹⁴⁾. Kromě těchto zmíněných hypotéz existuje celá řada dalších narušených systémů, jejichž činnost lze, alespoň dle dostupných experimentálních dat, modulovat ke zlepšení kognitivních projevů u pacientů s AD, ale i dalších typů demence, jako jsou např. Parkinsonova nemoc, Huntingtonova nemoc a jiné. Patří sem ovlivnění monoaminergního systému, extracelulární ukládání amyloidu beta (Aβ, součástí tzv. amyloidní hypotézy), intracelulární shluky hyperfosforylovaného τ-proteinu, kumulace některých kovů v mozku nebo oxidativní stres^15–19). Všechny tyto hypotézy však doposud zůstávají pouze v teoretické rovině a žádné další léčivo stavějící na této hypotéze neprošlo do klinického užívání²⁰⁾.

Nespornými výhodami MTDLs je kromě současného cílení na více patologických mechanismů onemocnění jejich omezení se pouze na jednu jedinou molekulu, u které sledujeme pouze jeden farmakodynamický a farmakokinetický profil, zcela odpadají lékové interakce a v neposlední řadě docílíme vyšší compliance u pacientů²¹⁾. Z pohledu medicinální chemie prošel vývoj MTDLs v posledních dvou dekádách značnými změnami. Zatímco dříve bylo nejjednodušším a nejvíce efektivním způsobem jak získat toto multipotentní léčivo spojení dvou farmakoforů přes příslušný alifatický řetězec, v současně době je od této strategie odklon směrem k ligandům, které vznikly překryvem dvou účinných struktur. Důvod pro tuto změnu je prostý, větší důraz je kladen na fyzikálně-chemické vlastnosti těchto sloučenin tak, aby byly účinné po perorální aplikaci, vykazovaly dobrou rozpustnost ve vodě a aby splňovaly kritéria pro prostup do CNS²²⁾.

Melatonin jako součást MTDLs

Pilotní studie multipotentních sloučenin na bázi takrinu, reverzibilního inhibitoru AChE a různých indolových fragmentů, tedy základního skeletu melatoninu, byla publikována v roce 2005²³⁾. Racionální podklad pro vývoj takovýchto duálních hybridů, kde obě dvě jednotky jsou navzájem spojené různými alifatickými řetězci nebo i dialkenylaminy, tvoří předpoklad o jejich schopnosti interagovat s oběma anionickými částmi AChE. Tato vlastnost je hojně vyhledávána s přihlédnutím k tzv. necholinergní roli AChE, kdy bylo zjištěno, že tento enzym je schopen podporovat agregaci Aβ skrze své periferní anionické místo (PAS) a interakce léčiva s touto částí se jeví jako velice zajímavý a inovativní přístup²⁴⁾. Řada sloučenin schopných selektivně ovlivňovat tuto část enzymu vskutku vykázala antiamyloidní profil.

V rámci výše zmíněné studie byly kombinovány dva různé takrinové fragmenty – takrin a jeho více účinný analog, 6-chlorotakrin, jež se orientují do katalytické části AChE^{25, 26)}. Indolový heterocykl byl zvolen nejen z důvodu strukturní příbuznosti k melatoninu, ale rovněž i k dalším příznivým farmakologickým vlastnostem. Nově vytvořená série takrin-indolových hybridů čítala celkově 26 sloučenin, všechny z těchto derivátů inhibovaly AChE izolovanou z lidského mozku v řádech subnanomolární až nanomolární účinnosti hodnot IC₅₀. Mimoto byl stanoven i inhibiční potenciál vůči jiné, příbuzné cholinesterase, a to butyrylcholinesterase z lidského séra (BChE, E.C. 3.1.1.8). I zde se projevila vysoká afinita těchto sloučenin vůči BChE, kdy se inhibiční potenciál pohyboval opět v subnanomolární až nanomolární účinnosti. Dvě nejvíce potentní sloučeniny na AChE/BChE 1 a 2 jsou znázorněny na obrázku 3. Za zmínku rovněž stojí vysoká selektivita sloučeniny 2 vůči BChE. Ta se může jevit velmi slibná s přihlédnutím k faktu, že aktivita a hladina AChE v průběhu AD klesá, zatímco hladina BChE zůstává ustálená nebo dokonce mírně vzrůstá²⁷⁾. BChE tak může přebrat úlohu AChE v hydrolýze neuromediátoru acetylcholinu (ACh)²⁸⁾. Duální charakter inhibice byl potvrzen molekulově modelovacími studiemi, kdy sloučenina 1 byla schopná interagovat s oběma anionickými částmi AChE. Dle předpokladu byla takrinová část zanořena dovnitř enzymatické kavity, kde byla sendvičovitě obklopena aminokyselinovými rezidui Trp84 a Tyr330 pomocí π-π a kation-π interakcí. Při vstupu do enzymu se nacházel indolový heterocyklus, který interagoval s Trp279, klíčovým aminokyselinovým reziduem PAS. Vybrané sloučeniny z této rodiny byly dále podrobeny testování vůči Aβ. Prvně byla sledována jejich schopnost inhibovat AChE-indukovanou agregaci tohoto proteinu při 100 µM koncentraci s nalezenou 84–98% schopností zamezovat shlukování Aβ do fibril. Dále byla zjištěna jejich přímá afinita k Aβ bez přítomnosti AChE. I v tomto případě docházelo k potlačení shlukování Aβ, avšak v menší míře (46–65 %). Buněčná viabilita testovaná na lidské neuroblastomové linii (SH-SY5Y) odhalila cytotoxický vliv pouze u některých sloučenin, a to až při koncentraci 10 µM. S přihlédnutím k faktu, že tato koncentrace je minimálně o řád vyšší, než se projevuje jejich terapeutický potenciál, lze tyto hybridy označit za bezpečné.

Navazující studie kombinovala opět různé takrinové deriváty (samotný takrin, 6-chlorotakrin nebo 6,8-dichlorotakrin) (obr. 3) s melatoninem²⁹⁾. Takto vzniklé heterodimerní sloučeniny inhibovaly obě cholinesterasy. Vyšší afinita a tedy i selektivní profil byly sledovány pro AChE, kde dosahovaly tyto multipotentní sloučeniny subnanomolárních až pikomolárních hodnot IC₅₀. Nejúčinnější sloučeniny 3 a 4 jsou znázorněny na obrázku 3. Testované sloučeniny dále vykázaly slibný antioxidační potenciál, přičemž jejich účinnost byla 1,7–4,0krát vyšší v porovnání s troloxem, rozpustným derivátem vitaminu E. Samotný melatonin má přibližně 2krát vyšší antioxidační potenciál než trolox³⁰⁾. Dle testu pro přechod přes hematoencefalickou bariéru pomocí pasivní difuze jsou všechny sloučeniny ze série na bázi melatoninu schopné průchodu³¹⁾.

Série 14 hybridních sloučenin na bázi melatonin-N,N--dibenzyl(N-methyl)aminů byla vyvinuta jako nové multifunkční sloučeniny pro možnou terapii AD³²⁾. Tato nová série se profilovala jako neselektivní s ohledem inhibice cholinesteras, kdy se afinita na oba zmiňované enzymy pohybovala v rozsahu mikromolárních hodnot IC₅₀. Test pro vytěsnění propidium dijodidu, selektivního ligandu pro PAS AChE, se používá v případě, kdy chceme prokázat přímou interakci sloučeniny s tímto místem³³⁾. Většina testovaných sloučenin byla schopná vytěsňovat propidium dijodid i při nejnižších testovaných koncentracích (0,3 µM) s vysokou účinností, až 45,2 %. Stanovený antioxidační potenciál byl velice podobný parentní sloučenině melatoninu; všechny hybridy měly 1,5–4,3krát vyšší účinnost než trolox (hodnota naměřená pro melatonin byla v tomto případě 2,4krát ekvivalent troloxu). Směs rotenonu a oligomycinu A byla použita v buněčném modelu SH-SY5Y k navození podmínek oxidativního stresu. Inkubace tohoto systému s 1 µM koncentrací dané sloučeniny byla schopná navodit neuroprotekci buněčné linie v rozsahu 12–36 %. Další test rovněž poukázal na schopnost melatonin-N,N-dibenzyl(N-methyl)aminů procházet hematoencefalickou bariérou pomocí pasivní difuze. Nejúčinnější hybridní sloučenina 5 z této série je znázorněna na obrázku 4.

Kombinace N-benzylpiperidinové části donepezilu s melatoninem vedla k další sérii multipotentních sloučenin³⁴⁾. Nejzajímavější molekulou z celé série byla 6 (obr. 4), která vykazovala shodně submikromolární inhibici AChE i BChE s mírně převažující afinitou k BChE. Kinetická studie prováděná na AChE odhalila smíšený typ inhibice, což odpovídá interakci s oběma anionickými částmi enzymu. To bylo i následně potvrzeno pomocí in silico metod, kdy se melatoninová část 6 orientuje do PAS, zatímco N-benzylpiperidinový fragment interaguje v katalytické části enzymu. Toto rozložení je shodné rovněž s krystalografickou strukturou pro donepezil v aktivním místě AChE³⁵⁾. V koncentraci 20 µM tyto sloučeniny na bázi MTDLs ovlivňovaly autoagregaci Aβ₄₂ od 38 % do 65 %. Tento efekt může pravděpodobně korelovat s chelatační schopností pro měďnaté ionty, kdy je ustanovena rovnováha mezi 6 a tímto kationtem v poměru 1 : 1. In vitro jsou tyto sloučeniny poměrně silnými antioxidanty, kdy jejich antioxidační potenciál dosahoval u některých až 3,94násobku účinnosti samotného troloxu. Vybrané sloučeniny ze série byly dále podrobeny protektivnímu experimentu na buněčné linii odvozené z feochromocytomu dřeně nadledvin laboratorního potkana (PC12). Jako sloučenina navozující toxický efekt byl v tomto případě použit peroxid vodíku. V 10 µM koncentraci tyto deriváty výrazně zvyšovaly viabilitu buněk. U všech sloučenin je rovněž předpoklad prostupu hematoencefalickou bariérou pomocí pasivní difuze.

Kurkumin (obr. 5) je přírodní sloučenina izolovaná z Curcuma longa L. (Zingiberaceae)³⁶⁾. Na její chemickou strukturu může být nahlíženo jako na biosyntetický dimer odvozený od fenylalaninu a kyseliny skořicové³⁷⁾. V tradiční medicíně se usušené kořínky této byliny používají k léčbě řady onemocnění, mezi které patří mimo jiné různé kožní defekty, povrchová zranění, revma, astma, alergie, jaterní potíže a další³⁸⁾. Kurkumin je především silným antioxidantem, mimoto ale rovněž pozitivně ovlivňuje řadu dalších patologických funkcí spojených s procesy neurodegenerace. Důležitý je zejména jeho neuroprotektivní účinek proti Aβ-indukovanému poškození nervových buněk, který byl prokázán na PC12 buněčné linie, má modulační účinky na fosforylaci τ-proteinu, čímž zabraňuje formování neurofibrilárních klubek, snižuje expresi β-sekretasy a tím nepřímo potlačuje produkci Aβ a v neposlední řadě je dobrým inhibitorem AChE^39–44). Nové hybridní sloučeniny kombinující melatonin s kurkuminem vykázaly řadu příznivých farmakologických účinků⁴⁵⁾. Zejména sloučenina 7 (obr. 5) se profilovala jako neuroprotektivum u neuroblastomové buněčné linie MC65 s efektivní koncentrací v nanomolární škále účinnosti (EC₅₀ = 27,60 nM). Podrobnější in vitro testování odhalilo inhibiční efekt vůči produkci oligomerů Aβ, samotný proces agregace tohoto proteinu však nebyl ovlivněn. Antioxidační efekt byl prokázán na stejné buněčné linii proti peroxidu vodíku i rotenonu. Negativní predikce průchodu přes hematoencefalickou bariéru s využitím lipidické membrány byla vyvrácena v in vivo modelu na myších, kde byl tento kurkuminový derivát po perorální aplikace (50 mg/kg) nalezen v mozku v efektivní koncentraci i za více než 24 h. Efekt tohoto heterodimeru byl následně potvrzen i na transgenním modelu myší s mutovaným amyloidním prekurzorovým proteinem a presenilinem 1⁴⁶⁾.

Estery kyseliny skořicové patří mezi induktory genu pro Nrf2. Nrf2 reguluje produkci celé řady antioxidačních a protizánětlivých proteinů, které chrání buňku proti oxidačnímu poškození⁴⁷⁾. Na základě této znalosti byla navržena a připravena série devíti melatonin-skořicových derivátů spadající do skupiny MTDLs⁴⁸⁾. Nově vzniklé hybridní sloučeniny vykázaly silný antioxidační potenciál, zejména pak derivát 8 (obr. 6) dosahoval devítinásobné účinnosti standardu troloxu. Neuroprotektivní vlastnosti byly ověřeny v modelu buněčné linie SHSY5Y s využitím směsi rotenonu a oligomycinu A jako toxických agens při 1 µM koncentracích testovaných substancí. Heterodimer 8 byl rovněž nejúčinnějším cytoprotektivem, kdy zvyšoval viabilitu buněk o 76,3 %.

Pinolin (obr. 7) lze považovat za cyklický analog melatoninu se zachovanými antioxidačními vlastnostmi⁴⁹⁾. Ten je s největší pravděpodobností tvořen biosyntetickými pochody z 5-methoxytryptaminu, ale definitivní důkazy pro toto tvrzení neexistují⁵⁰⁾. Strukturně aktivitní studie věnována pinolinu se zaměřila zejména na polohu methoxy skupiny a dále na vliv acetylace přítomné cyklické, sekundární aminoskupiny s ohledem na antioxidační aktivitu⁵¹⁾. Neacetylované deriváty v rámci studie rovněž vykázaly silnou afinitu k serotoninovým receptorům a serotoninovým transportérům. Submikromolární afinita byla shodně potvrzena pro všechny neacetylované deriváty pinolinu. Dle výsledků stanovení jsou tato cyklická analoga schopná rovněž inhibovat obě izoformy monoaminooxidas (MAO). Inhibice MAO-A může pozitivně přispívat k antidepresivnímu působení, zatímco důsledkem inhibice MAO-B je nepřímá antioxidační aktivita^{52, 53)}. Chování těchto sloučenin na melatoninových receptorech lze označit za parciální agonismus s převažující účinností na subtyp 2 melatoninového receptoru. Na základě predikce průchodu přes lipidickou membránu lze tyto sloučeniny označit za centrálně aktivní. Přímé stanovení antioxidačního potenciálu poukázalo na slabší efekt v porovnání s melatoninem nebo parentním pinolinem v rozsahu 1,38–2,39násobku účinnosti troloxu.

Homodimer (−)-meptazinolu byl popsán jako duální inhibitor AChE s antiagregační schopností proti Aβ⁵⁴⁾. Spojení (−)-meptazinolu s melatoninem vyústilo v nové sloučeniny typu MTDLs, které kromě vlivu na agregaci Aβ (autoagregace Aβ₄₂ i AChE-indukovaná agregace Aβ₄₀) byly podpořeny antioxidační aktivitou⁵⁵⁾. Nejúčinnější derivát 9 (obr. 8) lze označit jako AChE/BChE neselektivní, submikromolárně účinný inhibitor s vysokým antioxidačním potenciálem. Sloučenina 9 při 10 µM koncentraci inhibovala z 60 % autoagregaci Aβ₄₂, byla však méně účinná v porovnání s propidium dijodidem v případě AChE-indukované agregace Aβ₄₀.

Využití Ugiho multikomponentní syntézy vedlo k sloučeninám na bázi takrinu jakožto reverzibilního inhibitoru AChE a melatoninu, na které byly současně navázány buď kyselina lipoová nebo ferulová jako aditivní antioxidanty⁵⁶⁾. Smyslem této studie bylo navýšit antioxidační působení samotného melatoninu právě přídavkem jednoho ze dvou zmíněných farmakoforů. Za nejvíce širokospektrou sloučeninu lze označit 10 (obr. 9), která ve své struktuře obsahovala 7-Methoxytakrin. 7-Methoxytakrin je v současné době jedním z nejvíce protežovaných takrinových analog z důvodu nižší incidence hepatotoxicity v porovnání s takrinem⁵⁷⁾. Derivát 10 spojoval přes sedmi uhlíkatý řetězec melatonin a kyselinu ferulovou. Celkově vykázal multipotentní charakter, inhiboval účinně obě cholinesterasy, byl více selektivní pro BChE, je schopen prostupu přes hematoencefalickou bariéru na základě predikce průchodu přes lipidickou membránu a má výrazný antioxidační profil. Naproti tomu je o trochu více cytotoxický na jaterní linie (HepG2) v porovnání s takrinem. V dávce 1 µM se jevil jako velice silné neuroprotektivum neuronální buněčné linie SH-SY5Y při koaplikaci různých toxických agens zahrnujíc Aβ₄₀ (protekce 70,6 %), Aβ₄₂ (57,4 %), peroxid vodíku (37,6 %) a směsi rotenonu a oligomycinu A (33,7 %).

Závěr

Terapie neurodegenerativních onemocnění má v současné době pouze paliativní charakter. Neexistuje účinná léčba, která by byla schopna postihnout příčinu onemocnění, a dokonce není ani známo, co přesně je spouštěcím mechanismem. V řadě případů však panuje shoda, že nezvratné, neurodegenerativní procesy začínají řadu let před propuknutím symptomů. Současná společenská poptávka po účinném léčivu na tyto demence je zcela na místě, jelikož dlouhodobá prognóza není příliš příznivá a předpokládá se nárůst výskytu těchto onemocnění, což s sebou logicky nese obrovskou finanční zátěž, která se již nyní pohybuje okolo 1 % celosvětového hrubého domácího produktu⁵⁸⁾.

Roku 2003 bylo uvedeno na trh poslední léčivo na AD, memantin, od té doby postupně selhalo více než 200 jiných v různých fázích klinického hodnocení. V současném měřítku je AD považována za nejfrekventovanější multifaktoriální onemocnění, u kterého není přesně definována jedna příčina, jeden spouštěcí mechanismus, ale hned několik. Velmi často se hovoří o zánětlivém procesu, který je pozorován v prodromálních stadiích. Z těchto údajů jasně plyne, že je potřeba kriticky přehodnotit přístup nově vyvíjených antidementiv. Jako nejvíce perspektivní se za tímto účelem jeví vývoj multipotentních sloučenin, které nejčastěji kombinují různé farmakofory tak, aby bylo dosaženo účinku proti několika patologickým mechanismům onemocnění současně.

V předkládaném souhrnném článku je uvedena řada příkladů těchto MTDLs na bázi melatoninu, hormonu produkovaného epifýzou. Všechna tato data se shodují, že melatonin je účinným antioxidantem, který může zvrátit nebo výrazně potlačit zánětlivé procesy. Je rovněž vynikajícím neuroprotektivem. Velice často se dá vhodně kombinovat s jinými fragmenty z různých inhibitorů AChE (např. donepezil nebo takrin). V současné době chybí ve většině případů ověření konceptu těchto heterodimerních sloučenin postavených na melatoninu na zvířecím modelu demence. Teprve tyto navazující studie odhalí, zda jsou slibná in vitro data přenositelná na zvířata nebo dokonce na lidi v případě navazujících klinických studií. Prozatím jediným z výše uvedených derivátů, který byl podroben takovémuto in vivo stanovení na modelu transgenních myší, je kurkumin-melatoninový derivát 7.

Poděkování

Práce byla podpořena Dlouhodobým záměrem rozvoje a organizace – zdravotnická problematika ZHN (Fakulta vojenského zdravotnictví), finančními prostředky Fakultní nemocnice Hradec Králové (č. 00179906) a projektem Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 15-30954A.

Střet zájmů: žádný.

PharmDr. Jan Korábečný, Ph.D. (∗)

Centrum biomedicínského výzkumu Fakultní nemocnice Hr. Králové

Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové

Katedra toxikologie a vojenské farmacie, Fakulta vojenského zdravotnictví

Třebešská 1575, 500 02 Hradec Králové

e-mail: korabecny.jan@gmail.com