Fenolové látky v listových inzerciách Mentha × villosa Huds. cv. Snežná*

Souhrn

Rastliny čeľade Lamiaceae obsahujú účinné látky prevažne v listoch. V podčeľadi Nepetoideae, kam patrí rod Mentha L., ide hlavne o silicu a fenolové látky s antioxidačnou aktivitou, najmä hydroxyškoricové kyseliny s prevahou kyseliny rozmarínovej a flavonoidy. Medicínsky a priemyselne využívané sú najmä mäty M. × piperita a M. spicata, druh M. x villosa je u nás menej známy. Listové drogy sa spravidla hodnotia ako celok, ojedinele sa hodnotia jednotlivé listové inzercie. V tejto práci sa sledoval liekopisnými metódami v jednotlivých listových pároch Mentha × villosa Huds. cv. Snežná celkový obsah hydroxyškoricových derivátov (THD) vyjadrených ako kyselina rozmarínová a flavonoidov luteolínového typu, ktoré sa v tejto rastline vyskytujú v najväčšom množstve. Obsah THD vo vodných extraktoch listových párov kolísal v rozmedzí 6,7–9,4 %, v metanolových extraktoch 6,6–14,0 %. Flavonoidy stanovené ako luteolín-7-O-glukozid sa nachádzali vo vodných extraktoch v množstve 4,0–8,8 %, v metanolových extraktoch v množstve 4,0–10,5 %. Antioxidačná aktivita (DPPH) stanovená ako SC₅₀ kolísala vo vodných extraktoch listových párov v rozmedzí 10,2–16,9 μg.ml^–1 (suchej hmotnosti drogy), v metanolových extraktoch v rozmedzí 10,7 až 21,6 μg.ml^–1. Najvyšší obsah fenolových látok a najvyššia antioxidačná aktivita bola v extraktoch z vrcholových listov, najnižší obsah fenolových látok a najnižšia antioxidačná aktivita sa zaznamenala v extraktoch listov zo strednej časti stonky.

Kľúčové slová:
Mentha × villosa Huds. cv. Snežná • hydroxyškoricové deriváty • kyselina rozmarínová • luteolín-7-O-glukozid • DPPH

Úvod

Rastliny čeľade Lamiaceae sú dobrými zdrojmi fenolových látok, ktoré sa v súčasnosti intenzívne študujú pre ich antioxidačnú aktivitu. Významnou súčasťou tejto čeľade je rod Mentha L., ktorý sa zaraďuje do podčeľade Nepetoideae, typickej obsahom silice s prevahou monoterpénových zložiek a obsahom hydroxyškoricových derivátov, najmä kyseliny rozmarínovej (obr. 1)^1–4). Priemyselne a medicínsky využívanými druhmi rodu mäta sú hlavne Mentha × piperita L., M. spicata L. a M. crispa (M. spicata L. var crispa (Benth.) Danert), ktorým sa v literatúre venuje veľká pozornosť. Jedným z druhov, ktorý sa javí zaujímavým z hľadiska obsahu biologicky aktívnych látok, je aj druh M.× ⋅ villosa Huds. (mäta huňatá). Na Slovensku sa vyskytuje veľmi vzácne, ako liečivá rastlina sa nepoužíva a pestuje sa len ako aromatická silicová rastlina⁵⁾. Ide o hybrid druhov M. spicata L. a M. suaveolens Ehrh. Pestuje sa a medicínsky používa najmä v Brazílii pre obsah silice, v ktorej prevládajú p mentány substituované v polohe 6 (piperitenónoxid, karvón, dihydrokarvón) a pre obsah fenolových látok. Využíva sa najmä pre jej účinok analgetický⁶⁾, antibakteriálny⁷⁾, spazmolytický^4), hypotenzívny^{4, 8)}, antiparazitický v oblasti gastrointestinálneho traktu zvierat⁹⁾. Antioxidačný účinok je daný hlavne prítomnosťou fenolových látok, ako sú deriváty kyseliny hydroxyškoricovej a flavonoidy.

Antioxidačné pôsobenie vodného extraktu listov M. × villosa aj samotnej kyseliny rozmarínovej sa nedávno potvrdilo v pokusoch in vitro aj ex vivo. V pokuse ischémie-reperfúzie na mezentériu a ileu potkanov sa zaznamenalo štatisticky významné zníženie prítomnosti reaktívnych foriem kyslíka vo fáze reperfúzie. Pri analýze obsahových látok študovaného vodného extraktu (záparu) sa ako hlavné fenolové látky identifikovali flavonoidy, najmä glykozidy luteolínu a tiež hydroxyškoricové kyseliny, najmä kyselina rozmarínová¹⁰⁾.

Účinné obsahové látky sa v rastlinách čeľade Lamiaceae nachádzajú prevažne v listoch. Ich obsah závisí od pôvodu a vývinového štádia rastliny a iných vonkajších a vnútorných faktorov. Významná je aj ich rôzna tvorba a kumulácia v listoch rôzne starých, a teda na stonke umiestnených v rôznej výške. Rastliny podčeľade Nepetoideae sú typické najmä obsahom silice. Najvyšší obsah silice býva v mladých listoch nachádzajúcich sa na vrchole stonky a jej obsah postupne klesá v starších listoch na nižších inzerciách^{11, 12)}. Štúdiu kolísania obsahu fenolových látok v jednotlivých listových inzerciách sa venuje len ojedinelá pozornosť¹³⁾. Poznanie obsahu účinných látok v jednotlivých listových pároch však môže pomôcť pri voľbe správnej výšky rezu vňate pri zbere, aby sa získala celková listová droga požadovanej kvality.

Cieľom našej práce bolo overiť množstvo fenolových látok – hydroxyškoricových derivátov a flavonoidov, resp. celkového obsahu polyfenolov vo vodnom a metanolovom extrakte z jednotlivých listových párov Mentha × villosa ‘Snežná’ a stanoviť antioxidačnú aktivitu extraktov.

Experimentálna časť

Rastlinný materiál

Analyzovali sa suché listové páry druhu Mentha x villosa Huds. cv. Snežná. Rastliny sa pestovali v podmienkach juhozápadného Slovenska v Záhrade liečivých rastlín Farmaceutickej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave. Zbierali sa nekvitnúce výhonky v polovici júna a sušili sa pri izbovej teplote. Uchovávali sa v papierových obaloch v tme pri izbovej teplote. Zo suchých výhonkov sa oddelili jednotlivé listové páry a ich poradie sa označilo bazipetálne ako 1. pár až 15. pár (1p – 15p). Nerozvinuté vrcholové listy sa odobrali ako celok a označili ako rastový vrchol (RV). Analyzovalo sa 100 výhonkov. Vzorky sa pomleli tesne pred analýzami.

Stanovenie fenolových látok

Celkový obsah hydroxyškoricových derivátov (THD) sa stanovil spektrofotometricky pri 505 nm s Arnowovým skúmadlom a vyjadril ako kyselina rozmarínová¹⁴⁾; kyselina rozmarínová (RA) sa stanovila HPLC metódou v metanolovom extrakte a UV detekciou pri 320 nm¹⁵⁾; flavonoidy sa stanovili spektrofotometricky s AlCl₃ podľa Ph. Eur. 8¹⁴⁾ pri 392 nm podľa kalibračnej krivky ako luteolín-7-O-glukozid (obr. 2); polyfenoly (TP) a triesloviny (T) sa stanovili spektrofotometricky pri 760 nm s Folin-Ciocalteuovým skúmadlom a vyjadrili ako pyrogalol¹⁴⁾. Všetky analýzy sa robili v troch opakovaniach a prepočítali sa na sušinu.

Stanovenie antioxidačnej aktivity

Antioxidačná aktivita sa stanovila v extraktoch vodných (H₂O extrakt) a metanolových (MeOH extrakt) spektrofotometricky s DPPH radikálom pri 517 nm a vyjadrila sa ako SC₅₀ v μg.ml^–1 (suchej hmotnosti drogy)¹⁶⁾.

Chemikálie a skúmadlá

Všetky použité chemikálie mali kvalitu p. a., voda sa použila destilovaná a metanol na HPLC analýzu bol redestilovaný. DPPH (2,2-difenyl-2-pikrylhydrazyl) sa získal z fy Sigma Aldrich (Švédsko), kyselina rozmarínová z fy Aldrich (UK). Folin-Ciocalteuovo skúmadlo a Arnowovo skúmadlo sa pripravilo podľa Ph. Eur. 8¹⁴⁾. Roztok DPPH sa pripravil rozpustením 2,2 mg DPPH v 100,0 ml metanolu¹⁶⁾.

Prístroje

Analytické váhy ABJ – 4M (KERN, Nemecko); GENESYS 6 Spectrophotometer, Thermo – Electroncorporation (UK); kvapalinový chromatograf so súčasťami: GRADIENT PUMP BETA 10, dávkovací analytický ventil TYP D, UV detektor LCD 2082, dávkovacia slučka s objemom 20 μμl (ECOM, ČR), integrátor s programom CSW v.1.7 (Data Apex, ČR), kolóna Watrex Lichrospher 100 RP-18(e), zrnitosť 5 μm, rozmery 125 ⋅ 4 mm.

Výsledky a diskusia

Mäta huňatá je pomerne mohutná rastlina (vysoká 60–110 cm), husto ochlpená, s listami vajcovitými až elipsovitými, príjemne voňajúca. Pre analýzy sa zbierala vňať v nekvitnúcej fáze, výhonky s ojedinelými bočnými konárikmi dlhými 1–5 cm. Po vysušení sa z vňate oddelili jednotlivé listové páry, ktorých bolo v priemere 15 a predstavovali 53 % hmotnosti vňate, stonka tvorila 42 % hmotnosti a bočné konáriky 5 % hmotnosti. Listy dosahovali dĺžku 10–42 mm a šírku 5–22 mm. Hmotnostný podiel jednotlivých listových párov v celej listovej droge je uvedený na obrázku 3.

Hodnotenie obsahu fenolových látok v listových inzerciách sa robilo liekopisnými spektrofotometrickými metódami a zameralo sa najmä na tie dve skupiny obsahových látok, ktoré sa pri analýze vodného extraktu (záparu) M. × villosa ‘Snežná’ identifikovali ako látky prítomné v najväčšom množstve – glykozidy flavonoidu luteolínu a hydroxyškoricové kyseliny¹⁰⁾. Hodnotila sa prítomnosť látok tak vo vodnom extrakte, ako aj v metanolovom extrakte, ktorý sa získal pri stanovení kyseliny rozmarínovej.

Na stanovenie THD sa využila metóda s Arnowovým skúmadlom umožňujúca stanovenie tohto typu fenolových látok. Flavonoidy luteolínového typu sa stanovili metódou s chloridom hlinitým v kyslom prostredí, kedy sa u týchto látok tvoria komplexy s absorpčným maximom okolo 390 nm. Pre stanovenie celkového obsahu fenolových látok sa použila metóda s Folin-Ciocalteuovým skúmadlom, bežne používaná na overenie množstva fenolových látok v extraktoch¹⁴⁾. V metanolovom extrakte sa stanovila aj samotná kyselina rozmarínová HPLC metódou, vypracovanou pre tento typ extraktu u rastlín čeľade Lamiaceae¹⁵⁾.

Na extrakciu hydroxyškoricových kyselín a flavonoidných glykozidov je vhodný zriedený etanol, resp. metanol. Voda je vylúhovadlom pri príprave bylinných čajov. Vodné extrakty sa podľa Ph. Eur. 8 (ktorý je v súčasnosti platný na území Slovenskej republiky) využívajú na stanovenie obsahu polyfenolov, resp. trieslovín metódu s kožným práškom, kde sa látky trieslovinovej povahy identifikujú práve na základe ich schopnosti adsorbovať sa na kožný prášok¹⁴⁾. V čeľadi Lamiaceae sa nenachádzajú typické triesloviny, ale látky typu derivátov hydroxyškoricovej kyseliny (nazývané „triesloviny čeľade Lamiaceae“), ktoré tiež majú schopnosť absorbovať sa kožným práškom a táto metóda bola v minulosti jedným z postupov na ich stanovenie¹⁷⁾.

Vodný extrakt

Analýza vodných extraktov ukázala, že celkový obsah hydroxyškoricových derivátov vyjadrených ako kyselina rozmarínová stanovených s Arnowovým skúmadlom kolísal v listových pároch od 6,7 % do 9,4 %. Najvyšší obsah bol vo vrcholových listoch, najnižší v listoch umiestnených v strede stonky (obr. 4). Táto tendencia sa prejavila aj pri stanovení celkového obsahu polyfenolov s Folin-Ciocalteuovým skúmadlom (5,3–8,7 %), kde látky adsorbované kožným práškom (2,9 % do 4,2 %), ku ktorým sa zaraďujú aj hydroxyškoricové kyseliny, predstavovali podiel okolo 55 % celkových polyfenolov (obr. 5). Flavonoidy vyjadrené ako luteolín-7-O- -glukozid (4,0–8,8 %) sa z jednotlivých listových párov extrahovali v inom pomere ako THD a ich najvyšší obsah nebol v najmladších, ešte nerozvinutých listoch. V najväčšom množstve boli prítomné v 1. listovom páre, ich obsah výraznejšie klesal po listy umiestnené v strede stonky a potom sa ich obsah smerom k bazálnym listom ustálil (obr. 6). V najmenších vrcholových listoch, ktoré tvorili súčasť našej vzorky RV, nezistili prítomnosť flavonoidov ani Voirin et al. pri štúdiu listových inzercií M. × piperita¹³⁾.

Metanolový extrakt

Pri analýze metanolových extraktov jednotlivých listových párov sa zaznamenala podobná tendencia kolísania obsahu uvedených fenolových látok ako pri vodných extraktoch. Množstvo THD stanovené s Arnowovým skúmadlom sa v listových inzerciách pohybovalo od 6,6 % do 14,0 % (obr. 4) a množstvo polyfenolov (TP) stanovené s Folin-Ciocalteuovým skúmadlom od 6,2 % do 13,9 % (obr. 5). V metanolových extraktoch sa stanovila aj samotná kyselina rozmarínová, ktorá predstavovala väčšinou 45–55 % obsahu THD a jej množstvo v jednotlivých listových pároch kolísalo od 3,3 % do 5,9 % (obr. 4). Obsah flavonoidov bol 4,0–10,5 %, v najväčšom množstve boli prítomné opäť v 1. listovom páre, ich obsah následne klesal a od stredných listov smerom k bazálnym bol vyrovnaný (obr. 6).

Antioxidačná aktivita

Antioxidačná aktivita sa stanovila s DPPH radikálom a vyjadrila sa ako SC₅₀ v μg.ml^–1. Pri vodných extraktoch sa hodnoty SC₅₀ pohybovali v rozmedzí 10,2 až 16,9 μg.ml^–1 (obr. 7), pri metanolových extraktoch boli hodnoty SC₅₀ = 10,7 – 21,6 μg.ml^–1 (obr. 8). Antioxidačná aktivita korelovala najmä s obsahom hydroxyškoricových derivátov, resp. celkovým obsahom polyfenolov – v metanolovom extrakte sa prejavil najväčší vplyv kyseliny rozmarínovej (R² = 0,8751), vo vodnom extrakte vplyv celkového obsahu polyfenolov (R² = 0,8575). Korelácia s obsahom flavonoidov bola výrazne nižšia. Ich vplyv sa však prejavil najmä v listoch rastového vrcholu tak u vodných ako aj u metanolových extraktov, kde sa napriek najvyššiemu obsahu THD, resp. TP nezaznamenala najvyššia antioxidačná aktivita, pretože listy RV obsahovali výrazne nižšie množstvo flavonoidov typu luteolínu-7-O-glukozidu (obr. 7 a 8). Luteolín-7-O-glukozid je bežnou obsahovou látkou rastlín čeľade Lamiaceae a je známy vyššou antioxidačnou aktivitou^{16, 18)}. Určitý vplyv flavonoidov sa ukázal aj pri vodných extraktoch listov zo strednej a bazálnej časti stonky, vyššie množstvo flavonoidných glykozidov extrahovaných do vody zo stredných a bazálnych listov (obr. 6) sa prejavilo mierne vyššou antioxidačnou aktivitou v porovnaní s metanolovými extraktami (obr. 7 a 8). Všeobecne najvyššiu antioxidačnú aktivitu mali extrakty listových párov z vrcholu stonky, nižšiu extrakty listov z bazálnej časti stonky. Najnižšiu antioxidačnú aktivitu mali vodné extrakty 5. až 6. páru listov, čo koreluje s najnižším obsahom TP (obr. 5 a 7). Metanolové extrakty mali najnižšiu antioxidačnú aktivitu u listov 8. až 10. páru, kde sa zaznamenal najnižší obsah kyseliny rozmarínovej a THD (obr. 4 a 8).

Záver

Fenolové látky typu hydroxyškoricových kyselín (kyselina rozmarínová) a flavonoidov luteolínového typu resp. celkový obsah polyfenolov sa vo vňati M. ⋅×× villosa cv. Snežná nachádzal v najväčšom množstve vo vrcholových listoch (RV – 3. pár), ktoré však v celkovom listovom podiele tvorili menej ako 7 %. Najnižší obsah uvedených fenolových látok bol v listoch umiestnených v strede stonky. Pretože tieto listy tvorili najväčší podiel všetkých listov na stonke, ich kvalita je rozhodujúca pre výsledné hodnoty celej listovej drogy. Bočné konáriky majú podľa našich skúseností rovnakú tendenciu kolísania obsahu fenolových látok v listových pároch ako listy na hlavnej stonke. Podobné výsledky v kolísaní obsahu fenolových látok v listových inzerciách sme v minulosti zaznamenali aj v iných druhoch čeľade Lamiaceae^{11, 19, 20)}. Všeobecne možno konštatovať, že pri zbere mäty huňatej pre získanie listovej drogy s vyšším obsahom fenolových látok je vhodné zbierať celú olistenú časť stonky.

Práca bola podporená grantovým projektom VEGA MŠ SR č. 1/0290/16 (Komplexná analýza látok prírodného pôvodu s terapeutickým potenciálom v humánnej medicíne).

Za technickú spoluprácu ďakujeme pani laborantke Magdaléne Országovej.

Stret záujmov: žiadny.

Došlo: 15. júla 2016

Prijaté: 11. augusta 2016

RNDr. Daniela Tekeľová, CSc.  • S. Bittner Fialová • J. Tóth • Sz. Czigle

Univerzita Komenského v Bratislave

Farmaceutická fakulta, Katedra farmakognózie a botaniky

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, SR

e-mail: Daniela.Tekelova@uniba.sk