Mitochondriální enzym ABAD a jeho role v rozvoji a léčbě Alzheimerovy nemoci

Souhrn

Již delší dobu je známa souvislost mezi peptidem ß-amyloidem (Aß) a Alzheimerovou nemocí (AD). Původní hypotéza považující za hlavní toxickou formu Aß nerozpustné extracelulární plaky je dnes již překonána a zájem se upírá k rozpustným formám Aß a jejich působení uvnitř buňky. Je známo mnoho intracelulárních proteinů interagujících s Aß, mezi nimi též mitochondriální enzym amyloid vázající alkoholdehydrogenasa (ABAD). Vazba Aß na tento enzym poškozuje zatím ne zcela známým mechanismem mitochondrie a v konečném důsledku vede až k zániku buňky. V této práci jsou shrnuty dosavadní poznatky o enzymu ABAD, jeho roli v rozvoji AD a možnostech ovlivnění interakce ABAD-Aß jako potenciálním cíli pro farmakoterapii tohoto závažného onemocnění.

Klíčová slova:
Alzheimerova nemoc, amyloid-ß peptid, mitochondriální dysfunkce, amyloid vázající alkohol dehydrogenasa, frentizol

Úvod

Alzheimerova choroba je nejběžnějším neurodegenerativním onemocněním vyskytujícím se u starší populace. Poprvé bylo onemocnění popsáno na začátku 20. století Aloisem Alzheimerem. Je pro ni charakteristické progresivní poškození kognitivních funkcí a paměti. Ztráta mozkových funkcí vede k naprosté sociální nesamostatnosti a v konečném důsledku ke smrti. Navzdory intenzivnímu výzkumu není dosud známa přesná příčina vzniku AD a mechanismus patologie v raném stadiu onemocnění, a tedy ani neexistuje efektivní terapie.

Hlavními patologickými znaky vyskytujícími se v postižených oblastech mozku jsou přítomnost extracelulárních senilních plaků tvořených peptidem ß-amyloidem (Aß), intracelulárních neurofibrilárních klubek vznikajících agregací fosforylovaného tau-proteinu a ztráta neuronů, především cholinergních^{1, 2)}. AD je dále spjata se zánikem synapsí, poškozením mitochondrií a zánětlivou reakcí^3–7).

Ačkoliv není známa přesná příčina AD, předpokládá se, že hlavní roli v patologii onemocnění hraje zvýšená tvorba peptidu ß-amyloidu (Aß). Aß vzniká proteolytickým štěpením amyloidového prekurzorového proteinu (APP) enzymy ß- a γ-sekretasou. Při štěpení APP vznikají peptidy o délce převážně 40 a 42 aminokyselin^{8, 9)}. Původní hypotéza tzv. amyloidní kaskády předpokládala, že ukládání nerozpustného Aß v extracelulárním prostoru je prvotní příčinou rozvoje onemocnění. Novější data však ukazují, že nositelem toxicity jsou rozpustné formy Aß oligomerů vyskytující se intracelulárně, jejichž kumulace uvnitř buňky časově předchází vzniku senilních plaků^10–13). Na základě těchto zjištění byla upravena původní hypotéza a výzkum se zaměřil na působení Aß uvnitř buňky.

Stále více důkazů ukazuje na mitochondrie jako hlavní místo toxicity intracelulárního Aß (obr. 1)¹⁴⁾. Již delší dobu je známo, že AD je spojena s oxidativním stresem a poškozením mitochondrií. Byly zjištěny změny v počtu a velikosti mitochondrií¹⁵⁾, snížení energetického metabolismu¹⁶⁾, zvýšený oxidativní stres¹⁷⁾, poruchy homeostázy vápníku¹⁸⁾ a změny v mitochondriální DNA¹⁹⁾. Dále byla prokázána přítomnost Aß v mitochondriích zvířecího modelu onemocnění i u lidských pacientů a jeho negativní dopad na jejich fungování^{20, 21)}. In vitro bylo prokázáno, že Aß působí poškození dýchacího řetězce, snížení membránového potenciálu, únik cytochromu C, zvýšenou tvorbu mitochondriálního permeabilního tranzitního kanálu (mPTP) a zvýšenou tvorbu volných radikálů^22–24). Jakou cestou se Aß dostává do mitochondrií, zatím nebylo jednoznačně zodpovězeno. Nejpravděpodobnější se jeví možnost prostupu skrze transportní kanály TOM40 (vnější mitochondriální membrána) a TIM22 (vnitřní mitochondriální membrána)²⁵⁾. Další možností je transport přes tzv. MAMs (membrány asociované s mitochondriemi), které jsou součástí endoplazmatického retikula^{26, 27)}.

Bylo identifikováno několik mitochondriálních enzymů, které přímo interagují s Aß za ovlivnění jejich fyziologické funkce, např. ABAD, CypD, GAPDH, HtrA2^28–31). Mezi nimi amyloid vázající alkoholdehydrogenasa (ABAD) se zdá být klíčovou pro rozvoj neurotoxicky mitochondriálního Aß²¹⁾. V tomto článku jsou shrnuty dosavadní poznatky o tomto enzymu, jeho roli v rozvoji AD a možnostech farmakologického ovlivnění interakce ABAD-Aß jako perspektivním cíli pro terapii AD.

ABAD a jeho fyziologická funkce

Enzym ABAD poprvé popsali v roce 1997 Yan et al.²⁸⁾ a o rok později byl identifikován jako lidská obdoba dříve objevené hovězí hydroxyacyl-CoA dehydrogenasy typu II³²⁾. Původně byl označen jako ERAB (s endoplazmatickým retikulem asociovaný amyloid vázající protein) podle kompartmentu, ve kterém byl původně chybně identifikován. Jeho skutečná lokalizace je uvnitř mitochondriální matrix³³⁾. Enzym má ještě další alternativní názvy jako SCHAD³⁴⁾, HADH II³⁵⁾, 17ß-HSD10³⁶⁾, MBHD³⁷⁾. Tyto názvy byly odvozeny podle různých substrátů, jejichž přeměnu je ABAD schopen katalyzovat.

ABAD je NAD-dependentní oxidoreduktasa patřící do SDR (dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem) skupiny enzymů. Je to multifunkční enzym katalyzující redukci aldehydů a ketonů a oxidaci alkoholů (obr. 2)³⁸⁾. ABAD je poměrně málo substrátově specifický a experimentálně pro něj bylo popsáno mnoho potenciálních substrátů. Je však otázkou, které z nich enzym skutečně přeměňuje v prostředí organismu²⁷⁾.

Hlavní fyziologickou funkcí ABAD je pravděpodobně třetí krok ß-oxidace mastných kyselin s krátkým rozvětveným řetězcem, kde vystupuje jako L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenasa. Tomu by napovídala i lokalizace enzymu uvnitř mitochondriální matrix³⁹⁾. Z hlediska energetického metabolismu se jeví významná též schopnost metabolizovat ketolátky např. ß-hydroxybutyrát, a tím dodávat buňce energii při nedostatku kyslíku⁴⁰⁾. Účastní se též degradační cesty isoleucinu. Nesmyslná mutace v genu kódujícím ABAD vede k poruše katabolismu isoleucinu, která se klinicky projeví jako progresivní ztráta mentálních a motorických schopností, mentální retardací a epilepsií³⁷⁾.

Dalšími zvažovanými funkcemi jsou oxidace a inaktivace estradiolu a steroidních modulátorů GABA_A receptoru. Role ABAD v inaktivaci estradiolu by mohla vysvětlit, proč AD trpí častěji ženy než muži^{38, 41)}. ABAD je také pravděpodobně součástí mitochondriální RNAsy P. Tato funkce nesouvisí s enzymatickou aktivitou ABAD. RNAsa P je enzym důležitý pro správnou tvorbu tRNA a následně i syntézu proteinů v mitochondriích^42, 43).

Struktura a mechanismus funkce

ABAD se v buňce vyskytuje ve formě homotetrameru. Katalytická triáda sestává z aminokyselin Ser155, Tyr168 a Lys172 a je tedy stejná jako u ostatních enzymů z SDR skupiny³⁹⁾. Kofaktor NAD⁺/NADH se váže na enzym v blízkosti aminokyselin katalytické triády a vytváří s nimi nevazebné interakce. Vazebné místo pro substrát obsahuje oblast s kladně nabitými zbytky aminokyselin lysinu a histidinu, se kterými interaguje záporně nabitá část substrátů obsahujících v molekule CoA. Proto jsou substráty, které ve své molekule CoA neobsahují, enzymem přeměňovány méně efektivně. Hydrofobní oblast oddělující katalytickou triádu a oblast s kladným nábojem je vhodně uspořádána pro interakci s alifatickým řetězcem mastné kyseliny. Všechny tyto skutečnosti podporují domněnku, že acyl-CoA jsou primárním substrátem ABAD^{39, 44)}.

Mechanismus katalýzy lze přiblížit na příkladu redukce ketonu na alkohol. Tyr168 interaguje s karbonylovou skupinou substrátu, čímž zvyšuje elektrofilitu karbonylového uhlíku. Amoniová skupina Lys172 interaguje s tyrosinem za zvýšení jeho acidity. Donorem hydridu pro vlastní redukci je kofaktor NADH. Při přenosu hydridu na aktivovaný karbonyl současně dochází k deprotonaci Tyr168 a proton je přenesen na nově vytvořený hydroxylový anion. Záporný náboj vzniklý na Tyr168 je stabilizován vytvořením vodíkové vazby se Ser155³⁹⁾.

Na rozdíl od ostatních enzymů SDR skupiny obsahuje molekula ABAD navíc dvě sekvence aminokyselin (rezidua 102–107 a 141–146). Právě oblast zahrnující rezidua 102–107 a nacházející se v blízkosti aktivního centra enzymu je místem vazby Aß^{21, 39, 44)}.

Interakce ABAD-Aß a její důsledky

Interakce ABAD s Aß byla poprvé prokázána v roce 1997 pomocí kvasinkového dvouhybridního systému²⁸⁾. V následujících letech bylo toto zjištění potvrzeno za použití dalších metod, např. ELISA⁴⁵⁾, krystalografie²¹⁾, SPR (surface plasmon resonance)^{21, 46)}, ko-imunoprecipitace^{21, 28)} nebo imunocytochemie následované konfokální mikroskopií²¹⁾.

Vazebným místem Aß je oblast aminokyselinových reziduí 100–110, označovaná též jako Loop-D. Bodové mutace v oblasti Loop-D (konkrétně rezidua 98–101 a 108–110) zabránily vazbě Aß na enzym²¹⁾. Ostatní enzymy SDR skupiny tuto oblast ve své molekule neobsahují³⁹⁾. To by vysvětlovalo, proč pouze ABAD a nikoliv ostatní SDR enzymy interaguje s Aß.

Vazba Aß na enzym způsobí sterické změny v oblasti vazebného místa pro kofaktor NAD⁺, který se pak nemůže na enzym vázat, a tím je inhibována jeho funkce. Naopak enzym s navázaným kofaktorem s Aß neinteraguje. Ačkoliv se tedy Aß a NAD⁺ vážou na různá místa enzymu, jejich současné navázání se vylučuje^{21, 46)}.

Aß inhibuje funkci enzymu (K_i = 1,2–1,6 μM) pro substrát acetoacetyl-CoA^{47, 48)}. Zajímavé však je, že vazba Aß na ABAD je popsána již při koncentracích v řádu desítek nM^{28, 46)}. Možné vysvětlení předpokládá, že pro inhibici enzymu nestačí navázání monomerní formy Aß, ale je jí dosaženo až agregovanou oligomerní formou amyloidu²⁷⁾.

Byly provedeny pokusy na živých buňkách, které ve zvýšené míře exprimovaly v různých kombinacích ABAD, enzymaticky inaktivní ABAD, Aß nebo APP. Při těchto pokusech bylo zjištěno, že zvýšenou toxicitu vykazoval Aß (resp. APP) pouze v těch buňkách, které současně exprimovaly i funkční ABAD. Samotný Aß/APP nebo v kombinaci s inaktivní formou ABAD měl podstatně nižší toxické účinky. Z toho lze usuzovat, že toxicita Aß nespočívá v inhibici enzymu, ale ve změně jeho vlastností (např. funkce nebo lokalizace). Nositelem toxicity je tedy katalyticky aktivní enzym po navázání Aß, čemuž by odpovídalo i výše zmíněné zjištění, že vazba Aß na enzym probíhá již v o dva řády nižších koncentracích, než jaká je potřebná k jeho inhibici⁴⁷⁾. Při jiném experimentu potvrzujícím tuto domněnku vedlo podání protilátek proti ABAD ke snížení toxicity Aß²⁸⁾.

Proteomické studie odhalily dva proteiny, jejichž exprese se zvyšuje v důsledku interakce ABAD-Aß. Peroxiredoxin II je antioxidačně působící enzym a jeho zvýšená exprese působí protektivně proti toxickým účinkům Aß⁴⁹⁾. Druhý z proteinů, endofilin I (EP-I), působí naopak cytotoxicky, když aktivuje proapoptotickou signální kaskádu^{50, 51)}.

Mechanismus toxicity komplexu ABAD-Aß

Mechanismus, kterým Aß po navázání na ABAD rozvíjí svoji neurotoxicitu, není dosud znám, avšak existuje několik teorií. Nejčastěji zmiňovaná teorie předpokládá, že ABAD po navázání Aß produkuje toxické aldehydy HNE (4-hydroxynonenal) a MDA (malondialdehyd), které za normálních okolností naopak detoxikuje. Tato teorie je podpořena výsledky experimentů na buněčných liniích. V nich pouze buňky, které exprimovaly katalyticky aktivní ABAD a současně Aß, vykazovaly zvýšenou tvorbu HNE a MDA. Naopak buňky exprimující pouze ABAD vykazovaly zvýšenou odolnost proti toxickým účinkům těchto aldehydů. K tomu může docházet buď na základě změny funkce enzymu, anebo změny distribuce enzymu, jenž následně dostane možnost metabolizovat substráty z jiných kompartmentů^{47, 52, 53)}.

Jiná teorie předpokládá, že ABAD po interakci s Aß ve zvýšené míře metabolizuje hormon estradiol, ať už vinou změny distribuce enzymu, nebo v důsledku jeho zvýšené exprese a následně i aktivity³⁶⁾. Bylo prokázáno, že estradiol působí protektivně vůči toxickým účinkům Aß a jeho preventivní podávání snižuje riziko onemocnění AD⁵⁴⁾.

Další možností je poškození funkce mitochondriální RNAsy P, které je ABAD součástí. To by narušilo syntézu mitochondriálních proteinů, včetně součástí dýchacího řetězce, s následným poškozením energetického metabolismu buňky^{42, 43)}.

V neposlední řadě může být toxicita interakce ABAD-Aß zprostředkována proteinem EP-I, jehož exprese je v důsledku této interakce zvýšená. EP-I aktivuje enzym JNK (c-Jun N-terminální kinasa), který je součástí proapoptotické signální kaskády, což může v konečném důsledku vést až k zániku buňky. Zvýšená aktivace JNK je spojována s patologií AD již delší dobu a protein Ep-I se tak zdá být možným propojením mezi ní a působením Aß^{50, 51)}.

Ovlivnění interakce ABAD-Aß jako potenciální cíl terapie AD

Pro ověření, zda je Loop-D skutečně místem vazby Aß a zda její přerušení sníží toxicitu, byl syntetizován tzv. ABAD-návnadový peptid (ABAD-decoy peptide; ABAD-DP), jehož aminokyselinová sekvence (rezidua 92–120) oblast Loop-D zahrnuje. Předpokládalo se, že ABAD-DP vyváže Aß, a tím ochrání vlastní enzym. Peptid blokoval vazbu ABAD-Aß s K_i v řádu jednotek μM. K_d pro komplex Aß s ABAD-DP byla podobná jako pro ABAD-Aß. Při pokusech na buněčných liniích, které byly vystaveny působení Aß, snížilo podání ABAD-DP tvorbu volných radikálů, uvolňování cytochromu C z mitochondrií a zvýšilo životaschopnost buněk²¹⁾. Systémová léčba pomocí ABAD-DP (obohaceného o aminokyselinové sekvence umožňující přechod přes membrány a vstup do mitochondrií) u zvířecího modelu AD zlepšila kognitivní schopnosti v porovnání s neléčenou skupinou⁵⁵⁾. Na základě výše uvedených údajů se jeví interakce ABAD-Aß jako perspektivní cíl pro farmakoterapeutický zásah.

ABAD-DP je jako peptid svým charakterem nevhodný pro běžnou léčbu. Peptidy jsou málo dostupné po perorálním podání a v organismu mají nízkou stabilitu. Je proto snaha nalézt nízkomolekulární látky schopné inhibovat interakci ABAD-Aß. První výsledky v této oblasti publikoval Xie et al.⁴⁵⁾.

Byl proveden screening skupiny 50 látek, o nichž se vědělo, že interagují buď s Aß, nebo s ABAD, anebo působí neuroprotektivně, na schopnost inhibovat interakci ABAD-Aß. Aktivitu vykázaly tři sloučeniny: Aß vážící barviva Kongo červeň a thioflavin-T a neuroprotektivní látka resveratrol. Jako nejvhodnější kandidát pro další zkoumání byl vybrán thioflavin-T pro svou nízkou toxicitu a dobrý průnik přes biologické membrány. Při následném screeningu analogických struktur byla objevena účinnější látka frentizol, známé imunosupresivum a antivirotikum používané například k léčbě revmatické artritidy. Na základě předlohové molekuly frentizolu byla připravena a otestována série jeho strukturních analogů, z nichž dva nejúčinnější vykazovaly 30× vyšší inhibiční aktivitu vůči ABAD ve srovnání s frentizolem (obr. 3)⁴⁵⁾. Zatím však nebylo prokázáno, zda jsou inhibiční vlastnosti těchto látek specifické pro vazbu ABAD-Aß a zda jsou schopné snižovat toxicitu Aß.

Jinou možností jak zabránit ß-amyloidem indukované neurotoxicitě je inhibovat katalytickou funkci ABAD, která se pro ni jeví jako nezbytná. Tento přístup je však méně specifický pro vlastní onemocnění a bude jím ovlivněna i fyziologická funkce enzymu, což by se mohlo projevit v podobě nežádoucích účinků. Za tímto účelem byla testována sloučenina AG18051 (obr. 4)^{44, 56)}.

AG18051 je specifický inhibitor ABAD, který nemá strukturní podobnost se žádným ze známých substrátů. Váže se na aktivní místo enzymu, kde se orientuje do oblasti vazebného místa pro substrát a vytváří kovalentní vazbu s kofaktorem NAD⁺ (obr. 5). Na živých buňkách bylo potvrzeno, že inhibice ABAD pomocí AG18051 snižuje toxicitu Aß. Bylo též prokázáno, že AG18051 částečně brání vazbě Aß na ABAD. Vzhledem k mechanismu inhibice odpovídá toto zjištění výše zmíněné skutečnosti, že současná vazba kofaktoru a Aß na enzym se vylučuje. Schopnost inhibovat vazbu ABAD-Aß tak pravděpodobně přispívá k neuroprotektivním účinkům AG18051^{44, 56)}.

Závěr

ABAD je dosud nejlépe prozkoumaným intracelulárním proteinem interagujícím s Aß. Přímá vazba Aß na tento mitochondriální enzym byla jednoznačně prokázána pomocí různých metod. Interakce ABAD-Aß vede k poškození mitochondrií typickému pro AD. Inhibice této interakce tedy představuje perspektivní cíl pro terapii AD, což bylo potvrzeno za použití ABAD-DP. První pokusy o nalezení nízkomolekulárního inhibitoru vedly k syntéze série derivátů frentizolu. Pro další vývoj léčiv tohoto typu je však nezbytné hlouběji porozumět podstatě interakce ABAD-Aß a zjistit přesný mechanismus jejího toxického působení.

Střet zájmů: žádný.

O. Benek

Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Katedra toxikologie a Centrum pokročilých studií, Hradec Králové

doc. PharmDr. Kamil Musílek, Ph.D.

Univerzita Hradec Králové, Přírodovědecká fakulta, Katedra chemie

Rokitanského 62, 500 03 Hradec Králové, Česká republika

e-mail: kamil.musilek@gmail.com

K. Kuča

Fakultní nemocnice, Hradec Králové